1.1復(fù)色光對(duì)比耳定律的偏離

比耳定律成立的前提條件是入射光是單色光，但是精度再高的儀器，即使是雙單色器的分光光度計(jì)，也只能獲得近乎單色的光，無法獲得純單色光，它仍然含有狹窄光通帶，具有復(fù)色光的性質(zhì)。而復(fù)色光會(huì)導(dǎo)致比耳定律的正或負(fù)偏離。固定狹縫的紫外分光光度計(jì)計(jì)光譜帶寬一般為1nm或2nm，可調(diào)狹縫的可以做到0.1nm;可見分光光度計(jì)計(jì)帶寬6nm、10nm，甚至十幾納米。光譜帶寬應(yīng)該是越小越好，但是隨著光譜分辨率的提高，儀器的靈敏度降低，所以選擇儀器時(shí)要綜合考慮各種條件的影響。當(dāng)溶液濃度較小且單色光較純時(shí)，可近似認(rèn)為符合比耳定律。

1.2雜散光的影響
雜散光是指進(jìn)人檢測器的處于待測波長光譜帶寬范圍外的其他波長組分，它是光譜測量中誤差的主要來源。產(chǎn)生原因有:分光光度計(jì)的色散元件、反射鏡、透鏡及單色器內(nèi)壁灰塵等。在分光光度計(jì)工作波段邊緣波長處，由于單色器透光率、光源輻射強(qiáng)度、檢測器靈敏度都較低，雜散光的影響更為顯著。雜散光限制儀器的分析上限可引起嚴(yán)重的測量誤差，實(shí)際工作中，在定量分析時(shí)，一般在吸收峰或其附近處測量樣品吸光度，如果在分析波長處含有雜散光，這時(shí)樣品的透光率較小，而雜散光大部分透過，使測量吸光度低于真實(shí)吸光度。

1.3儀器噪聲對(duì)測結(jié)果的影響
儀器噪聲也是儀器的一個(gè)重要指標(biāo)，它表征儀器做稀溶液的能力。是疊加在待測量的分析信號(hào)中的不需要的信號(hào)，掃描100%T和0%T線，可觀察到分光光度計(jì)的絕對(duì)噪聲水平，如果儀器噪聲較大，會(huì)掩蓋較小的測量信號(hào)，一般用噪音的二倍來表示儀器的靈敏度。

1.4波長和吸光度準(zhǔn)確度
樣品的每一個(gè)值都是在一定的波長下測得的，如果波長誤差很大，測出的值肯定不準(zhǔn)。吸光度準(zhǔn)確度也是用戶對(duì)儀器的直接要求，更應(yīng)引起足夠的重視。國家計(jì)量檢定規(guī)程規(guī)定雙光束紫外可見分光光度計(jì)透射比準(zhǔn)確度為A級(jí)士0.6%, B級(jí)土1.0%。

測量條件的選擇

2.1參比溶液和溶荊的選擇
分光光度計(jì)的測量實(shí)際上是以通過參比池的光強(qiáng)度作為人射光強(qiáng)度來測定試樣的吸光度，先調(diào)節(jié)儀器使透過參比池溶液的吸光度為零，然后讓同一束光通過樣品，使得吸光度比較真實(shí)地反映待測物質(zhì)的濃度，所以參比溶液的選擇非常重要。如果僅有待測物質(zhì)與顯色劑的反應(yīng)產(chǎn)物有吸收，可用純?nèi)軇┗蛘麴s水作參比溶液。如果顯色劑有顏色，并在測定波長下有吸收，則用顯色劑溶液作參比溶液，所加人顯色劑及其它試劑的量，與試樣中的加入量應(yīng)一致。如果樣品中其它組分本身的顏色對(duì)測定有干擾，而所用顯色劑沒顏色，則用不加顯色劑的樣品溶液作參比液。

正確選擇合適的溶劑，對(duì)提高分析的準(zhǔn)確度起重要作用。為減小溶劑中雜質(zhì)的影響，應(yīng)選擇高純度的溶劑;溶劑應(yīng)不與待測物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng);待測物在溶劑中要有一定的溶解度;在測定的波長范圍內(nèi)，溶劑本身沒有吸收，注意常用溶劑的最短可用波長;當(dāng)用揮發(fā)性大的溶劑時(shí)，測量過程中吸收池應(yīng)加蓋。

2.2測試波長的選擇
當(dāng)用分光光度計(jì)對(duì)溶液進(jìn)行測定時(shí)，首先需要選擇合適的測量波長。選擇的依據(jù)是該被測溶液的吸收曲線。在一般情況下，我們總是選擇最大吸收波長作為測量波長，這樣可以提高靈敏度。而在有些情況下最大吸收峰很尖銳、吸收過大或附近有干擾存在，就不能選最大吸收波長，而必須在保證有一定靈敏度的情況下，選擇吸收曲線中的其它波長進(jìn)行測定（曲線較平坦處對(duì)應(yīng)的波長），以消除干擾。繪制吸收曲線是正確選擇波長的有效手段和方法。

2.3吸光度范圍的選擇
試樣在不同吸光度時(shí)，濃度的相對(duì)誤差不同，一般選擇A二0.2一0.8之間，濃度相對(duì)誤差較小，可以通過改變吸收池厚度、檢測波長或待測溶液濃度，使吸光度讀數(shù)在適宜范圍內(nèi)。

2.4狹縫寬度的選擇
狹縫寬度不僅影響光譜的純度，也影響吸光度值，在定量分析時(shí)，為了得到足夠的測量信號(hào)，應(yīng)采用較大狹縫。在定性分析時(shí)，為了提高分辨率，應(yīng)采用較小狹縫，以獲得精細(xì)的光譜結(jié)構(gòu)。

2.5吸收池的選擇和使用
吸收池的規(guī)格應(yīng)根據(jù)被測溶液顏色深淺來確定，一般是被測溶液顏色深時(shí)選光程短的，顏色淺時(shí)選光程長的，同一實(shí)驗(yàn)使用同一規(guī)格同一套吸收池。在定量測量之前需要對(duì)吸收池作校正和配對(duì)工作，吸收池不匹配時(shí)，對(duì)測量產(chǎn)生誤差，吸收池方向不同，透光率亦有差異，使用時(shí)應(yīng)注意方向。比色皿毛玻璃一面的上端有一個(gè)箭頭，應(yīng)與光路保持一致。另外，使用時(shí)，不要把溶液注得太滿，以防在推動(dòng)比色皿架時(shí)溶液溢出皿外。如透光壁外有溶液存在，要擦干再測，否則將產(chǎn)生誤差。

2.6溫度的選定
溫度對(duì)溶液顏色的深淺和吸光度都有影響，溫度升高，紫外一可見光譜吸收向短波方向移動(dòng)。故在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定樣品時(shí)，應(yīng)保持溫度一致，通常在室溫條件下進(jìn)行。

儀器的正確使用和保養(yǎng)也很重要，我們應(yīng)該做到以下幾點(diǎn):堅(jiān)持標(biāo)準(zhǔn)溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，不使用過期溶液;比色皿應(yīng)保持清潔、干燥，禁止用硬物碰擦透明表面;防止儀器振動(dòng)，影響測量穩(wěn)定性;在開機(jī)狀態(tài)，不測量時(shí)，應(yīng)打開樣品池門，延長光電傳感器壽命;樣品集中測量，避免開機(jī)次數(shù)，延長光源壽命;一旦停機(jī)，則應(yīng)待燈冷卻后再重新啟動(dòng)，并預(yù)熱15 min左右再使用;要經(jīng)常更換儀器的干燥劑，防止光學(xué)元件和光電傳感器受潮生霉;儀器搬動(dòng)或更換重要部件后，要重新進(jìn)行性能確認(rèn)，以保證測量結(jié)果的準(zhǔn)確。